Ueber Essigbildung mittels Bacterien; von Emanuel Wurm in Breslau. Wurm, über Essigbildung mittels Bacterien. Die Umwandlung alkoholischer Flüssigkeiten in Essig ist seit langer Zeit Gegenstand wissenschaftlicher Besprechung. Während Pasteur die Essigbildung für einen durch die Vegetation einer Bacterienart (Mycoderma aceti) bedingten physiologischen Proceſs hält, vertritt Liebig die Ansicht der rein chemischen Einwirkung des Sauerstoffes auf Alkohol. Pasteur (1862 165 303) stützte seine Theorie durch zahlreiche Beobachtungen und veröffentlichte i. J. 1862 auf Grund derselben ein neues Verfahren der Essigfabrikation, das er in seinem i. J. 1868 erschienenen Werk: „Études sur le vinaigre“ weiter ausführte. Er schlug vor, die Essigbildung in der Weise vor sich gehen zu lassen, daſs man auf ein Gemisch von Wein und Essig oder auch Wasser, 1 Proc. Essigsäure und 2 Proc. Alkohol nebst mineralischen Nährsalzen den Essigpilz aussäet und, nachdem etwa die Hälfte des ursprünglich angewendeten Alkohols in Essigsäure übergegangen ist, täglich kleine Mengen Alkohol zusetzt, bis die Flüssigkeit so viel Alkohol erhalten hat, daſs der Essig den im Handel verlangten Grad besitzt. Um die alkoholischen Flüssigkeiten zuzusetzen, ohne dabei durch unmittelbare Berührung den Pilz zu zerstören, sind auf dem Boden der Kufe zwei Röhren aus Guttapercha befestigt, die seitwärts mit kleinen Löchern versehen sind. Die Flüssigkeit darf nicht über 20cm hoch sein. Im J. 1871 theilten Breton-Laugier in Orleans (1871 201 67) mit, daſs sie auf Grund der Pasteur'schen Beobachtungen eine Fabrik für Weinessig eingerichtet hätten, in welcher die Essigbildung 7 bis 10 mal rascher vor sich gehe, als nach dem bisherigen Verfahren des Säuerns der Weine in groſsen Mutterfässern. Die Société d'Encouragement de l'industrie nationale bewilligte den Inhabern den für Verbesserungen in der Essigfabrikation ausgesetzten Preis von 1000 Franken. In Deutschland fanden die Ansichten Pasteur's keinen günstigen Boden, besonders da Liebig in seiner Abhandlung: „Ueber die Gährung und die Quelle der Muskelkraft“ (Annalen der Chemie und Pharmacie, 1870 Bd. 153 S. 137) seine schon früher ausgesprochene Ansicht, die Essigbildung aus Alkohol sei nicht bedingt durch einen physiologischen Proceſs, die Essigsäure nicht ein Product der Mycoderma aceti, sondern das Product eines chemischen Oxydationsprocesses, aufrecht hielt und zum Belege seine Beobachtung anführte, daſs ein Span aus der untersten Schicht eines Essigbildners, der seit 25 Jahren zur Fabrikation diente, bei der mikroskopischen Untersuchung keinen Essigpilz enthalten habe. Prof. Otto schrieb i. J. 1866 in seinem „Lehrbuch der Essigfabrikation“, daſs er das neue Verfahren von Pasteur geprüft habe und nicht für praktisch ausführbar halte. Da die neueste Auflage des Werkes (bearbeitet von Prof. Bronner, 1876) diese Notiz ohne weitere Bemerkung bringt und auch die übrigen Technologien keine weiteren Mittheilungen enthalten, so scheint die Pasteur'sche Essigbildungsmethode in Deutschland bis jetzt technisch nicht durchgeführt zu sein, obwohl durch die Arbeiten von Mayer und v. Knierym (Landwirtschaftliche Versuchsstation, 1873 Bd. 16 S. 305) die physiologische Theorie eine wesentliche Stütze erhielt. Dieselben wiesen nach, daſs auch bei der Fabrikation mittels Essigbildnern auf den Spänen Mycoderma aceti zahlreich vorhanden sei. Beobachtungen, welche ich im pflanzenphysiologischen Institut zu Breslau auf Anregung des Hrn. Prof. Ferd. Cohn zu machen Gelegenheit hatte, stellten es auſser Zweifel, daſs eine lebhafte Essigbildung mittels der Vegetation von Mycoderma aceti (Bacterium Mycoderma, Cohn) stattfinde. Ermuntert durch die im Kleinen erhaltenen günstigen Resultate und auf Grund der Pasteur'schen Angaben suchte ich die Fabrikation von Spiritusessig technisch durchzuführen, was auch in völlig befriedigender Weise gelang. In der von mir zu diesem Zweck für einen Industriellen in Breslau errichteten Fabrikanlage benutzte ich groſse hölzerne Bottiche, welche mit 200l der Essigmischung, bestehend aus Essig, Wasser und Alkohol, sowie mit den von Pasteur angegebenen mineralischen Nährsalzen (phosphorsaures Kalium 0,01 Proc., phosphorsaurer Kalk 0,01 Proc., phosphorsaure Magnesia 0,01 Proc., phosphorsaures Ammoniak 0,02 Proc.) beschickt wurden. Die Bottiche sind mit hölzernen Deckeln fest zugedeckt. Der Luftzutritt geschieht durch kleine Löcher in den Seitenwänden. Die Aussaat des Pilzes wird mittels eines hölzernen, dünnen Spatels bewirkt, wie schon von Breton-Laugier angegeben; die Ansatzflüssigkeit ist auf 25 bis 30° erwärmt, der Fabrikationsraum hat eine constante Temperatur von 30°. Der Essiggehalt der Ansatzflüssigkeit soll nach Pasteur 1 Proc. betragen. Fortgesetzte Beobachtungen zeigten uns aber, daſs eine so schwach saure Flüssigkeit leicht von dem Kahmpilz (Saccharomyces Mycoderma) befallen wird, welcher die Ausbreitung des Essigpilzes und die Essigbildung verhindert, indem er den in der Flüssigkeit vorhandenen Alkohol direct zu Kohlensäure verbrennt. – Versuche, welche wir über den Einfluſs des Säuregehaltes auf die Entwicklung von Bacterium Mycoderma und Saccharomyces Mycoderma anstellten, ergaben, wenn beide ausgesäet wurden, daſs bei 0,5, 1,0 und 1,2 Proc. Essigsäure eine ausschlieſsliche Vermehrung der Kahmhaut, bei 1,6 Proc. eine vorwiegende des Essigbacteriums und bei 2 Proc. Säure eine Reinkultur desselben erzielt wird. Der von Pasteur angegebene Ansatz von 2 Vol.-Proc. Alkohol erwies sich als vortheilhaft. Die Essigbildung ging nun in der Art vor sich, daſs der ausgesäete Pilz in 12, 24 bis 36 Stunden die ganze Oberfläche des Bottiches bedeckte. Die mikroskopische Prüfung stellte ich unter Anleitung von Prof. Cohn an, dem ich an dieser Stelle für seine rege Theilnahme und Unterstützung, welche er mir während meiner ganzen Arbeit gewährte, meinen tiefgefühlten Dank ausspreche. Das Resultat war folgendes: Die bald mehr, bald weniger dicke und schleimige Bacterienhaut erwies sich nicht stets als eine gleiche, sondern es konnten deutlich drei verschiedene Formen beobachtet werden, von denen wir vorläufig unentschieden lassen müssen, ob dieselben sich aus einander entwickeln und nur verschiedene Zustände desselben Organismus sind, oder ob, wie Mayer vermuthete, verschiedene Essigsäure erzeugende Formen bestehen (vgl. Cohn: Beiträge zur Biologie der Pflanzen, 1872 Bd. 1 S. 173). Bei einem Säuregehalt von 1 bis 3 Proc. beobachteten wir vorzugsweise eine dicke, fettig schleimige Decke, bestehend aus äuſserst kleinen Kügelchen (Mikrokokken), die im jungen Zustande dünn und reihenförmig an einander gelagert, nach einigen Tagen durch Bildung von Intercellularsubstanz in einen dickeren Zoogloea-Zustand übergingen. Bei steigendem Säuregehalt bildeten sich in der Decke Adern, Streifen und Flecken von dünner Beschaffenheit, die sich mehr und mehr ausbreiteten, während die vorhandene Decke zu Boden sank. Die neue, zartere und weniger schleimige Haut besteht aus einer Bacillusform von wechselnder Länge, dicht an einander und neben einander gelagert. Auch diese Decke verschleimte mit der Zeit und machte einer neu entstehenden dünneren Bacillenhaut Platz, besonders wenn Unregelmäſsigkeiten im Alkoholzusatz stattfanden. Bei einem Säuregehalt über 4 bis 5 Proc. zeigten sich lange und kurze unregelmäſsig gekrümmte und aufgeschwollene Fäden. Ein Unterschied im Säuerungsvermögen dieser verschiedenen Formen konnte bis jetzt nicht genau beobachtet werden; festgestellt wurde, daſs sich die Bacillen auch auf 1procentiger Mischung vermehren, während die Mikrokokkusformen nur bei niederem Säuregehalt dichte Häute bildeten. Die Beobachtung Mayer's daſs der Essigpilz sehr empfindlich gegen den Wechsel des Säuregehaltes sei, wird hierdurch auf die Mikrokokken eingeschränkt. Einen weit wesentlicheren Einfluſs auf die Vegetation der verschiedenen Formen müssen wir dem Alkoholgehalt der Flüssigkeit zuschreiben; besonders wird der schleimige Zustand stets durch einen zu niedrigen Alkoholgehalt bedingt. Zur Aussaat eignen sich nur dünne, 2 bis 4 Tage alte Häute, während schleimige Mikrokokken und Bacillenhäute langsamer auswachsen. Sobald die Oberfläche des Bottiches völlig bedeckt ist, steigt bei einer Zimmerwärme von 30° die Temperatur der Flüssigkeit auf 34°; zugleich macht sich ein starker Geruch nach Essigsäure im Bottich bemerkbar. Der Säurezuwachs, welcher täglich titrimetrisch festgestellt wurde, schwankte zwischen 0,2 bis 0,4 Proc., beeinfluſst von der Höhe des Alkoholprocentsatzes. – Die zugesetzten 2 Vol.-Proc. Alkohol sollen theoretisch 2 Proc. Essigsäure liefern, die praktische Ausbeute ist aber eine geringere. Nach Bronner's Berechnungen über Spanbildner beträgt der Verlust an Alkohol bei Darstellung von gewöhnlichem Essigsprit 23 Proc., bei stärkeren Sorten 12 bis 15 Proc. Bei dem von uns angewendeten Verfahren tritt ein Verdunstungsverlust nur anfänglich ein, später wird derselbe durch die Pilzdecke verhindert; insgesammt stellt er sich auf 10 bis 15 Proc. Dieser Alkohol dient theils dem Essigbacterium zum Aufbau seiner Bestandtheile, theils wird aus ihm durch Einwirkung der Essigsäure bei der herrschenden hohen Temperatur Essigsäureäther gebildet. Die 2 Vol.-Proc. Alkohol lieferten 1,7 bis 1,8 Proc. Essigsäure. Um stärkeren Essig zu erzielen, muſs also der Essigmischung noch Alkohol zugesetzt werden. Pasteur machte schon darauf aufmerksam, daſs hierbei die Essigbildung leicht vernichtet werden kann, wenn die zuzusetzende Flüssigkeit zu stark an Alkohol ist; nach unseren Erfahrungen darf der Alkoholzusatz erst eintreten, wenn nur noch ½ bis ⅓ Proc. Alkohol in der Mischung vorhanden ist, und darf dann nur so erfolgen, daſs die mit dem Pilz in Berührung kommende Flüssigkeit nie viel über 0,5 Proc. Alkohol enthält. Um diese Vertheilung durchzuführen, befindet sich in der Mitte des Bottiches eine groſse, starke Porzellanröhre, die vom Boden bis an den Flüssigkeitsspiegel mit Löchern versehen ist. Durch diese wird der mit Essig aus demselben Bottich stark verdünnte Alkohol in zweckmäſsiger Weise zugesetzt und zwar täglich 0,4 Proc., so daſs nie ein gröſserer Ueberschuſs vorhanden ist. Es gelang uns so die Essigbildung bis auf hohe Procentsätze auszudehnen; je höher der Säuregehalt stieg, desto genauer muſste die zuzusetzende Alkoholmenge mit der verbrauchten übereinstimmen. Hat der Essig den gewünschten Stärkegrad erlangt, so wird derselbe auf ein Klärfaſs abgelassen, um ihn von der durch die Pilztheilchen bewirkten Trübung zu befreien. Der Bottich wird hierauf durch Bürsten gut gereinigt und neu beschickt. Haupterfordernisse für das Gelingen sind: reine Bacterienaussaat, gleichmäſsige Temperatur von 30° und regulirter Alkoholzusatz. Bei richtiger Beobachtung dieser Umstände ist das neue Verfahren leicht durchführbar und gewährt gegenüber dem bisherigen folgende Vortheile: 1) Betrachtet man die Leistung in gegebener Zeit als Werthmesser, so ergibt sich, daſs das neue Verfahren doppelt so schnell producirt als das bisherige System der Schnellessigfabrikation. Einen Maſsstab erhält man durch Vergleichung des Anlagekapitals. Nach den Angaben von Otto liefern drei zusammenarbeitende Essigbildner bei 3m Höhe und stündlichem Aufgieſsen täglich etwa 120l Essigsprit von 4,5 bis 5 Proc. Essigsäure. Dieselbe Production wird geleistet von 10 Bottichen, denn jeder Bottich säuert täglich im Durchschnitt 0,3 Proc.; dies beträgt also für die 200l Inhalt eines Bottiches täglich 600g Essigsäure, entsprechend etwa 13l Essigsprit von 4,5 Proc. 10 Bottiche nebst Zubehör kosten kaum die Hälfte so viel als 3 Bildner mit Füllung in obiger Gröſse. 2) Der Raum, welchen die Bottiche in Anspruch nehmen, muſs nicht wie bei den Bildnern von bestimmter Höhe sein, da das Gröſsenverhältniſs der Bottiche willkürlich gewählt sein kann. Er ist bei zweckmäſsiger Aufstellung noch nicht so groſs als der von Bildnern in Anspruch genommene. 3) Ein groſser Uebelstand der Essigfabrikation im Allgemeinen ist das Auftreten der Essigaale (Anguillula aceti), welche die Fabrikation völlig zum Stillstand bringen können. Wie Pasteur zeigte, drängen sie sich in Folge ihres starken Bedürfnisses nach Sauerstoff an die Oberfläche der Essigmischung, zerreiſsen durch ihre drehende Bewegung die Pilzdecke und verhindern eine Neubildung derselben. Auf den Bildnern überziehen sie die Späne mit ihrer schleimigen Masse und machen hierdurch eine directe Berührung des Pilzes mit der Flüssigkeit unmöglich. Sobald sie sich reichlich vermehren, sinkt die Temperatur der arbeitenden Mischung. Mitunter gelingt es, besonders wenn äuſsere Abkühlung vermieden wird, auf den Bottichen die zerstörte Pilzdecke wieder zuwachsen zu lassen; alsdann flüchten sich die Aale an den oberen Rand und bilden einen schleimigen Ring oberhalb der Bacterienhaut. Aehnlich gestaltet sich der Vorgang bei den Spanbildnern; auch hier bedecken die Aale, wenn die Bacterienbildung Oberhand gewinnt, die Wände des Fasses. Mitunter treten sie jedoch in solcher Menge auf, daſs die Essigbildung stillsteht. Die Beseitigung der Aale ist alsdann mit groſsen Schwierigkeiten verknüpft. Die Bildner müssen ihrer Späne theilweise entleert und mit kochendem Essig gebrüht werden. Hierdurch geht jedoch auch der in denselben befindliche Essigpilz zu Grunde, so daſs sie erst nach 4 bis 8 Wochen, wenn sich in Folge frischer Aufgüsse eine neue Vegetation auf den Spänen gebildet hat, wieder zu arbeiten anfangen. Es ist ersichtlich, daſs bei der Pasteur'schen Methode die Aale nicht die Zeit finden, sich in so störender Weise zu vermehren, da ein Bottich nach 10 bis 15 Tagen abgelassen und gereinigt wird. Es ist nur darauf Rücksicht zu nehmen, daſs die Pilzaussaat nicht etwa von einer aaligen Flüssigkeit stammt, was aber, da die Aale mit blosem Auge deutlich wahrnehmbar sind, leicht vermieden werden kann. Ist dennoch ein Bottich aalig geworden, so wird derselbe abgelassen, die Flüssigkeit mittels kochenden Wassers oder Dampf auf 60° erwärmt, der Bottich mit kochendem Wasser und etwas Schwefelsäure gescheuert und mit der erwärmten und wieder erkalteten Flüssigkeit von neuem angesetzt. Bei sauberer Behandlung der Bottiche und Erhitzung des zum Ansatz dienenden Essigs auf 60° können die Aale überhaupt nicht auftreten. Um den fertigen Essig vor dem Aaligwerden auf dem Lager zu schützen – ein Uebelstand, welcher durch Unsauberkeit der Lagerfässer sehr häufig eintritt, ist nur das eine Mittel anwendbar, daſs der Essig in groſsen Fässern bei beschränktem Luftzutritt auf 60° erhitzt wird. Pasteur gibt hierfür in seinem oben erwähnten Buche eine praktische Einrichtung an. Von antiseptischen Mitteln wirkt Salicylsäure vorzüglich conservirend: 0,01 Proc., also 10g auf 1hl genügen, um Essig vor den Aalen zu schützen, bezieh. vorhandene Aale zu tödten; doch wird die Anwendung derselben leider durch den Umstand verhindert, daſs sie mit der geringsten Spur Eisen eine tiefblaue Färbung hervorbringt. Da Essig aber sehr häufig im Haushalt mit Eisen in Berührung kommt, ferner Salicylsäure haltiger, kochender Essig auch grüne Pflanzentheile, wie z.B. Gurken, in Folge ihres reichlichen, Eisen führenden Chlorophylls schwarzblau färbt, so ist dieses bequeme Conservirungsmittel für Essig ausgeschlossen. Als Antisepticum wirkt auch Borsäure und zwar bei einem Zusatz von 0,04 Proc., d.h. 40g auf 1hl. Nach 3 bis 5 Tagen wurden die in einem Essig reichlich enthaltenen Aale hierdurch getödtet. Da der Borsäure in der geringen Menge, in welcher sie bei Benutzung des Essigs in die Speisen gelangt, keine gesundheitsschädlichen Eigenschaften zugesprochen werden können, so steht ihrer Benutzung wohl nichts im Wege. Früher wurde von den Fabrikanten eine geringe Menge Schwefelsäure zur Conservirung angewendet, die Sanitätsbehörden gestatten jedoch diesen Zusatz nicht. Selbstverständlich kann ein mit Chemikalien conservirter Essig nicht weiter zur Fabrikation dienen, da die benutzten Mittel auch auf das Essigbacterium antiseptisch wirken. Am rationellsten ist es daher, den Essig auf 60° nach der Pasteur'schen Methode zu erwärmen; bei der Fabrikation mit Bottichen ist hierdurch die Möglichkeit der Aalbildung völlig ausgeschlossen. Die Essigfliege, Musca cellaris L., welche sich überall einfindet, wo saure Flüssigkeiten verdunsten, kann ebenfalls eine Ansteckung durch Aale bewirken, indem dieselbe, über den oben beschriebenen Aalrand hinwegkriechend, an ihren Füſsen Aale verschleppt und auf gesunde Bottiche oder Bildner überträgt. Bei den Bottichen vermeidet man dies dadurch, daſs die Deckel derselben fest schlieſsen, auch die Porzellanröhren gut verdeckt und die Luftlöcher mit Baumwolle verstopft werden. Bei den Spanbildnern kann durch das beständige Aufgieſsen auf dieselben Unsauberkeit des Arbeitsraumes durch Verdunsten vergossenen Essigs nicht leicht vermieden werden; auch der den Bildnern selbst entströmende Dunst wirkt stark anziehend auf die Fliegen, deren Zutritt zu den Bildnern nicht verhindert werden kann, während die Bottiche auf oben abgegebene Weise völlig vor denselben geschützt sind. 4) Das Ansäuern eines neuen Spanbildners nimmt 6 bis 8 Wochen in Anspruch; nach Berechnungen von Paul Pfund (vgl. 1874 211 285) saugt ein Bildner 5 bis 6hl Essig zum Ansäuern der Späne ein, der erzeugte Essig besitzt während der ersten 4 Wochen einen starken Holzgeschmack von den Spänen; ferner müssen die Bildner in ununterbrochener Arbeit gehalten werden. Die Pasteur'sche Methode der Essigbildung mittels Bacterien liefert dagegen sofort ohne jeglichen Essigverlust gute Waare; der Betrieb kann beliebig unterbrochen werden, wenn nur für genügende Aussaat fortdauernd gesorgt wird. Diese Art der Fabrikation ist einfacher, sicherer und auch billiger bezieh. schneller als die bisherige mit Spanbildnern; allerdings ist eine tägliche genaue Controle der arbeitenden Bottiche erforderlich. Ungenügende Vertheilung des zuzusetzenden Alkohols, zu groſser Ueberschuſs desselben in der säuernden Flüssigkeit bewirken sofort Verlangsamung oder Stillstand der Gährung. Bei richtiger Befolgung der festgestellten Verhältnisse bietet jedoch die technische Ausführung keine Schwierigkeiten. Für die Production von Weinessig ist dieses System das allein rationelle; da dieselbe einen Alkoholzusatz nicht erfordert, gestaltet sich dieser Fabrikbetrieb noch einfacher.